Kháng sinh tác động lên tế bào vi khuẩn theo các cơ chế:

• Ức chế sự thành lập vách tế bào.
• Ức chế nhiệm vụ của màng tế bào.
• Ức chế sự tổng hợp protein.
• Ức chế sự tổng hợp acid nucleic.

Nhóm Aminoglycoside ức chế sự tổng hợp protein của vi khuẩn: bằng cách gắn vào protein tiếp nhận trên đơn vị 30S của ribosome làm đọc sai thông tin của ARN, làm hình thành các protein không có hoạt tính, ngoài ra còn làm tách các protein ở trạng thái polymer thành monomer.

Gồm 4 giai đoạn:

• Giai đoạn 1 thuốc gắn vào Protein là thụ thể chuyên biệt ở trên tiểu đơn vị 30S của ribosome vi khuẩn.
• Giai đoạn 2 thuốc phong bế hoạt tính của phức hợp đầu tiên "initiation complex" của quá trình thành lập chuỗi Peptide (ARNm + formylmethiomine + ARNt).
• Giai đoạn 3 thông tin ARNm bị đọc sai ở vùng nhận diện (recognition region) của ribosome, kết quả là một acid amin không phù hợp được đưa vào chuỗi peptide, tạo một Protein không có chức năng.
• Giai đoạn 4 sự gắn của thuốc làm vỡ các polysome thành các monosome không có khả năng tổng hợp Protein, các tác động này xảy ra ít nhiều có tính đồng thời và kết quả là tế bào vi khuẩn bị giết.

Trong số các vi khuẩn Gram dương, kanamycin cũng như aminoglycoside thường có tác dụng đối với tụ cầu vàng và tụ cầu S. epidermitis, nhưng theo báo cáo 1997 của ASTS khoảng 38% đã kháng thuốc.

Tuy nhiên, aminoglycosid không có tác dụng đối với liên cầu khuẩn, và đa số chủng vi khuẩn đường ruột Enterococcus kháng thuốc. Ðối với các chủng Mycobacterium, kanamycin có hoạt tính in - vitro với các chủng M. kansaii, M. marinum và M. intracellulosa. Tuy nhiên, tác dụng lâm sàng của kanamycin với các chủng này so với các aminoglycosid khác chưa được chứng minh đầy đủ.

Thường có sự kháng thuốc chéo giữa kanamycin, neomycin và paromycin, nhưng không thấy kháng chéo giữa kanamycin và streptomycin với các chủng Mycobacterium như với các chủng vi khuẩn khác.

Ðối với M. tuberculosis, nếu kanamycin dùng đơn độc thì chủng này sẽ kháng rất nhanh.